LRRK2-IN-1 CAS 1234480-84-2 Biologische Aktivität

In vitro

Die Wildtyp- und G2019S-Transduktion führt zu einem 2,5-fach höheren TR-FRET-Signal, das durch inhibiert werden kannLRRK2-IN-1dosisabhängig mit IC50-Werten von 0,08 µM bzw. 0,03 µM [1]. LRRK2-IN-1 besaß einen IC50 von 45 nM zur Hemmung von DCLK2 und zeigt einen IC50 von mehr als 1 uM, wenn es in biochemischen Assays für AURKB, CHEK2, MKNK2, MYLK, NUAK1 und PLK1 bewertet wurde. Es wurde bestätigt, dass LRRK2-IN-1 MAPK7 mit einer EC50 von 160 nM hemmt. LRRK2-IN-1 induziert eine dosisabhängige Hemmung der Ser910- und Ser935-Phosphorylierung, begleitet von einem Verlust der 14-3-3-Bindung an Wildtyp-LRRK2 und LRRK2 [G2019S], die stabil in HEK293-Zellen transfiziert sind [2]. LRRK2-IN-1 ist mit einem IC 50 -Wert von 49,3 uM in HepG2-Zellen mäßig zytotoxisch. LRRK2-IN-1 zeigt Genotoxizität in Gegenwart und Abwesenheit von S9 bei 15,6 bzw. 3,9 uM [3]. LRRK2-IN-1 hemmt die Proliferation, Migration und induziert den Zelltod mit Merkmalen der Apoptose von HCT116- und AsPC-1-Zellen [4].

In vivo

LRRK2-IN-1 (100 mg / kg, ip) induziert die Dephosphorylierung von LRRK2 in der Niere der Mäuse [2]. Die peritumorale Injektion von LRRK2-IN-1 (100 mg / kg) führt zu einer signifikanten Abnahme des Tumorvolumens und des Gewichts von AsPC-1-Tumor-Xenotransplantaten [4].

Kinase-Assay

Aktives GST-LRRK2 (1326-2527), GST-LRRK2 [G2019S] (1326-2527), GST-LRRK2 [A2016T] (1326-2527) und GST-LRRK2 [A2016T + G2019S] (1326-2527) ) Das Enzym wird 36 h nach vorübergehender Transfektion der geeigneten cDNA-Konstrukte mit Glutathionsepharose aus HEK293-Zelllysat gereinigt. Doppelt durchgeführte Peptidkinasetests werden in einem Gesamtvolumen von 40 & mgr; l durchgeführt, das 0,5 & mgr; g LRRK2-Kinase (die bei ungefähr 10% Reinheit eine Endkonzentration von 8 nM ergibt) in 50 mM Tris / HCl, pH 7,5, 0,1 mM enthält EGTA, 10 mM MgCl 2, 20 uM Nictide, 0,1 uM [γ-32P] ATP (500 cpm / pmol) und die angegebenen Konzentrationen des in DMSO gelösten Inhibitors. Nach 15-minütiger Inkubation bei 30 ° C werden die Reaktionen beendet, indem 35 & mgr; l des Reaktionsgemisches auf P81-Phosphocellulosepapier getupft und in 50 mM Phosphorsäure getaucht werden. Die Proben werden ausgiebig gewaschen und der Einbau von [γ-32P] ATP in Nictide wird durch Cerenkov-Zählung quantifiziert. IC50-Werte werden mit GraphPad Prism unter Verwendung einer nichtlinearen Regressionsanalyse berechnet.

Zellassay

Zellen (104 Zellen pro Vertiefung) werden dreifach in eine Gewebekulturplatte mit 96 Vertiefungen ausgesät. Die Zellen werden in Gegenwart von LRRK2-IN-1 mit DMSO als Vehikel bei 0, 0,31, 0,63, 1, 2 und 5, 10 und 20 uM kultiviert. 48 h nach der Behandlung werden 10 & mgr; l TACS MTT-Reagenz in jede Vertiefung gegeben und die Zellen werden bei 37 ° C inkubiert, bis ein dunkler kristalliner Niederschlag in den Zellen sichtbar wird. Dann werden 100 & mgr; l 266 mM NH 4 OH in DMSO in die Vertiefungen gegeben und 1 Minute bei niedriger Geschwindigkeit auf einen Plattenschüttler gestellt. Nach dem Schütteln wird die Platte 10 Minuten vor Licht geschützt inkubiert und der OD550 für jede Vertiefung wird unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts abgelesen. Die Ergebnisse werden gemittelt und als Prozentsatz der DMSO (Fahrzeug) -Kontrolle + / - der Standardfehler des Mittelwerts berechnet.

Tier Admin

LRRK2-IN-1wird in Captisol gelöst und durch intraperitoneale Injektion in männliche Wildtyp-C57BL / 6-Mäuse in einer Dosis von 100 mg / kg verabreicht. Kontrollmäusen wird ein gleiches Volumen Captisol injiziert. Zu Zeitpunkten von 1 und 2 Stunden werden Mäuse durch Genickbruch ausgelöscht und Nieren- und Hirngewebe schnell präpariert und in flüssigem Stickstoff eingefroren.

Verweise

[1]. Hermanson SB et al. Screening auf neuartige LRRK2-Inhibitoren unter Verwendung eines TR-FRET-Zellassays mit hohem Durchsatz für die Phosphorylierung von LRRK2 Ser935.PLoS One. 2012; 7 (8): e43580. Epub 2012 Aug 28.

[2]. Deng, Xianming et al. Charakterisierung eines selektiven Inhibitors der Parkinson-GG-Kinase LRRK2. Nature Chemical Biology (2011), 7 (4), 203 & ndash; 205.

[3]. Koshibu K et al. Alternative zu LRRK2-IN-1 für pharmakologische Studien der Parkinson-GG-Krankheit. Pharmakologie. 2015; 96 (5-6): 240-7.

[4]. Weygant N et al. Der niedermolekulare Kinaseinhibitor LRRK2-IN-1 zeigt eine starke Aktivität gegen Darm- und Bauchspeicheldrüsenkrebs durch Hemmung der Doppelkortin-ähnlichen Kinase 1. Mol Cancer. 2014, 6. Mai; 13: 103