β-Nicotinamid-Mononukleotid (NMN) -Produktion in Escherichia coli

Abstrakt

Diabetes ist eine chronische und fortschreitende Krankheit, deren Prävalenz stetig zunimmt und die die weltweiten Gesundheitssysteme finanziell unter Druck setzt. Kürzlich wurde die Insulinresistenz, ein Kennzeichen von Typ-2-Diabetes, bei Mäusen geheilt, die mit dem NAD ⁺ -Vorläufer β-Nicotinamid-Mononukleotid (NMN) behandelt wurden , wobei keine toxischen Wirkungen berichtet wurden. NMN weist jedoch einen hohen Preis auf, und es werden kostengünstigere Herstellungsverfahren benötigt. Diese Studie schlägt eine biotechnologische NMN-Produktionsmethode in Escherichia coli vor . Wir zeigen, dass die bicistronische Expression von rekombinanter Nicotinamid-Phosphoribosyltransferase (Nampt) und Phosphoribosylpyrophosphat (PRPP) -Synthetase in Gegenwart von Nicotinamid (NAM) und Lactose eine erfolgreiche Strategie für eine kostengünstige NMN-Produktion sein kann. Proteinexpressionsvektoren, die das NAMPT-Gen von Haemophilus ducreyi und die PRPP-Synthetase von Bacillus amyloliquefaciens mit L135I-Mutation tragen, wurden in Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS transformiert. Die NMN-Produktion erreichte ein Maximum von 15,42 mg pro l Bakterienkultur (oder 17,26 mg pro g Protein) in diesen Zellen, die in PYA8-Medium, ergänzt mit 0,1% NAM und 1% Lactose, gezüchtet wurden.

Einführung

Nach Angaben der International Diabetes Federation belief sich die Zahl der Erwachsenen mit Typ-2-Diabetes 2017 auf 425 Millionen. Bis 2045 sollen es 649 Millionen sein. Weltweit werden 12% des Gesundheitsbudgets (oder 727 Milliarden US-Dollar) ausgegeben zur Behandlung von Diabetes. Jüngste Studien haben die Insulinresistenz, das Kennzeichen von Typ-2-Diabetes, mit der Abnahme der Mitochondrienfunktion und den verringerten NAD ⁺ -Spiegeln sowie dem ebenfalls im Alter beobachteten NAD ⁺ / NADH-Verhältnis in Verbindung gebracht. NAD ⁺ kommt in allen lebenden Organismen vor und ist ein bekanntes Coenzym bei Oxidations-Reduktions-Reaktionen. NAD ⁺ -abhängige Proteindeacetylasen wie SIRT1 und SIRT6 dienen als metabolische Sensoren und regulieren nachgeschaltete Signalwege, die schließlich die Mitochondrienfunktion und die Insulinsensitivität wiederherstellen. Dieser Befund erweitert den Forschungsbereich der NAD ⁺ -Effekte auf andere mit dem Altern verbundene degenerative Krankheiten wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Krebs, Arthritis, Osteoporose oder Alzheimer.

Das β-Nicotinamid-Mononukleotid (NMN) ist ein Zwischenprodukt der NAD ⁺ -Biosynthese, das aus Nicotinamid (NAM) und Phosphoribosylpyrophosphat (PRPP) durch das Nicotinamid-Phosphoribosyltransferase-Enzym (Nampt) hergestellt wird (EC 2.4.2.12). NMN wurde gut vertragen, hatte keine Nebenwirkungen bei der Langzeitanwendung bei Mäusen und verhinderte den altersbedingten physiologischen Rückgang. Es erwies sich als wirksam bei der Behandlung von Typ-2-Diabetes mit hohem Fettgehalt, indem es die mit dem Altern verbundene mitochondriale Dysfunktion aufhob und rettete die Wirkung des altersbedingten Rückgangs in neuralen Stammzellen.

NAM wird normalerweise von Enzymen, die an den NAD ⁺ -Sammelwegen beteiligt sind, wie Nampt, in NMN umgewandelt. Die Wirkung dieses Enzyms macht die anabole Hauptaktivität von NAD ⁺ in der Zelle aus. Die Regulation des Nukleotidstoffwechsels und der Biosynthese von Säugetieren oder Mikroorganismen erfolgt normalerweise durch den Verzehr von PRPP. PRPP resultiert aus Ribose-5-phosphat über sowohl oxidative als auch nicht oxidative Zweige des Pentosephosphatweges.

In Bakterien wird NAM am häufigsten durch Nikotinamidase in Nikotinsäure (NA) umgewandelt, die in den Preiss-Handler-Signalweg integriert ist. Dies gilt auch für Escherichia col . Bei Säugetieren wurde keine Nicotinamidase-Aktivität berichtet; NAM wird stattdessen durch eines der NAM-Phosphoribosyltransferaseenzyme in NMN umgewandelt. Obwohl den meisten Bakterien die NAM-Phosphoribosyltransferase fehlt, wird das Enzym in Haemophilus ducreyi und Shewanella oneidensis exprimiert .

Einfache und metabolisch vielseitige Organismen wie Escherichia coli werden in der Biotechnologie häufig zur kontrollierten Expression von Proteinen mit gewünschter enzymatischer Aktivität verwendet. Die DNA, die für solche Enzyme kodiert, wird häufig durch Expressionsvektoren wie das pET-System von Novagen in Bakterien eingeführt. Die pET-Vektoren werden in Bakterien transformiert, die T7-RNA-Polymerase wie E exprimieren. coli BL21 (DE3). Die Kontrolle der Expression von Enzymen wird mit dem lac- Promotor erreicht, der die Expression nur in Gegenwart von Lactose (ebenfalls metabolisiert als Kohlenstoffquelle) oder seinem synthetischen Strukturanalogon Isopropyl-1-Thio-β-D-Galactopyranosid (IPTG) einschaltet ( nicht metabolisiert, mit konstanter Konzentration während des Wachstumsprozesses). Da der bakterielle Metabolismus vielseitig ist, sind die Variation der Kohlenstoffquelle und die Konzentration von mit Medium supplementierten Enzymsubstraten Schlüsselfaktoren, die in einem biotechnologischen Prozess berücksichtigt werden müssen.

Um das derzeitige Hochpreisproblem von NMN anzugehen, haben wir in unserer vorherigen Arbeit eine Reinigungsmethode aus Bakterienzellen vorgeschlagen. Zur weiteren Prozessoptimierung, da wir nur eine veröffentlichte Hefeproduktionsmethode finden konnten, schlägt diese Studie eine einfache und kostengünstige biotechnologische NMN-Produktionsmethode in Escherichia coli vor .

Ergebnisse

Bakterielle Transformation

Das für mutmaßliches NadV aus Haemophilus ducreyi , NadV, Shewanella oneidensis MR-1 und Nampt aus Mus musculus erzeugte Alignment mit mehreren Aminosäuresequenzen zeigt eine hohe Ähnlichkeit (Abb. S1) und macht alle diese Enzyme zu Kandidaten für einen biotechnologischen Prozess.

Transformiert E. coli- Zellen mit von pET28a (+) - Plasmiden getragenen nadV (NAMPT) -Genen bildeten Kolonien auf den mit Kanamycin supplementierten LB-Agar-Platten. Auf Platten, die mit nicht transformierten Bakterienzellen inokuliert waren, wurden keine Kolonien nachgewiesen. Die Agarosegelelektrophorese der aus diesen Kolonien isolierten Plasmid-DNA bestätigte das Vorhandensein der Plasmide Nampt-PET28a, pET28a-soNadV oder pET28a-hdNadV in E. coli DH5α (Ergänzende Fig. S2A, Spur 2, 3, 4). Die DNA-Banden stimmten mit den Banden von E überein. coli BL21 (DE3) -pLysS-Zellen (Ergänzende Fig. S2A, Spur 6, 7, 8), die mit entsprechenden Plasmiden transformiert wurden, die direkt aus E extrahiert wurden. coli DH5α. In nicht transformiertem E. coli BL21 (DE3) -pLysS-Zellen, die als Negativkontrolle verwendet wurden, wurde das Vorhandensein des pLysS-Plasmids durch Elektrophorese bestätigt, und auf Agarosegel wurde eine Bande gezeigt, die mit der bekannten Länge von 4886 bp übereinstimmt (ergänzende Fig. S2A, Spur 5).

(Weitere experimentelle Daten finden Sie auf der Original-Website: https://www.nature.com/articles/s41598-018-30792-0#Sec14)